Аномалия гена протромбина 20210 G/A

В семьях пациентов с тромбозами обнаруживается аутосомно-доминантное наследование F2:20210 G/A.

В настоящее время установлена связь этой генетической аномалии с гиперпродукцией протромбина. Однако, несмотря на наличие технической возможности определить повышенный уровень протромбина, выявление этой патологии должно быть основано исключительно на данных ПЦР Высокие чувствительность и специфичность ПЦР обеспечивают синтезированные in vitro олигонуклеотиды, комплементарные соответствующему участку гена протромбина человека.

Принцип метода

Для идентификации полиморфных аллелей в гене F2 используют амплификацию соответствующих участков гена методом ПЦР с последующей детекцией продуктов амплификации.

Реактивы и оборудование

• Для определения аномалии F2:20210 G/A применяют следующие праймерыпраймер 1 (forward primer) - 5'-TGGGAAATATGGCTTCTACA-3' (нуклеотиды 20035-20054); праймер 2 (reverse primer) — 5'-CACTGGGAGCATTGAAGCT-3' (нуклеотиды 20229-20211).
• Контрольные образцы с аллелем дикого типа и аллелем мутантного типа.
• Амплификатор и другое оборудование для выполнения ПЦР.

Образцы крови для исследования Материалом для исследований может быть любой источник ДНК, однако чаще используют венозную кровь, которую забирают в пробирки, содержащие ЭДТА Образцы хранят до проведения исследования при температуре +2...+8 °С не более 24 ч. Длительно хранить образцы можно в замороженном состоянии при -40..-70 °С.

Выделение ДНК из образцов клинического материала может проводиться разными методами, например с помощью наборов на основе силики, наборов с микроцентрифужными колонками, наборов на основе фенол-хлороформной экстракции и др.

Техника выполнения

Метод основан на многократном избирательном копировании участка ДНК с помощью ферментов in vitro. Ход исследования должен соответствовать выбранному оборудованию и процедуре ПЦР-анализа (гель-электрофорез, flash или др.).

Оценка результатов исследования

Оценка результатов проводится способами, позволяющими визуализировать олигонуклеотидные полиморфные замены. Фрагменты ДНК определяют с помощью разных флюоресцентных красителей, специфично связывающихся с ДНК.

Интерпретация результатов исследования

Для многих носителей этого полиморфизма характерны тромбозы различной локализации, риск которых существенно увеличивается при наличии беременности, применении контрацептивов, в послеоперационный период и др. Пенетрантность гена неполная, в этой связи некоторые носители не имеют в анамнезе тромботических нарушений. При наличии гомозиготного варианта этого полиморфизма возраст первого эпизода меньше, а частота, и тяжесть тромбозов выше. Частота обнаружения гетерозиготной аномалии, по данным литературы, составляет около 1-2 % в популяции. При наличии F2:20210 G/A уровень протромбина у пациентов примерно в 1,5-2 раза выше нормы.

Обнаружение указанной аномалии гена протромбина у пациентов с рецидивами тромбозов позволяет обосновать пролонгированную антикоагулянтную профилактику. Такое исследование оказывает помощь в выявлении беременных с повышенным риском Тромбозов.

Причины ошибок

• Ошибки преаналитического этапа исследования (при нарушении сроков хранения или неправильной транспортировке биоматериала нуклеиновые кислоты могут разрушаться, что становится причиной ложноотрицательных результатов; гепарин способен ингибировать реакцию ПЦР, поэтому забор крови не должен проводиться в пробирки, содержащие этот антикоагулянт).
• Загрязнение исследуемых образцов инородным биологическим материалом.
• Нарушение принципов зонирования лаборатории для молекулярно-генетических исследований.
• Отказ от исследования отрицательного контроля.
• Отказ от проведения повторного анализа положительных проб.
• Несоблюдение технологии выделения ДНК.
• Специфичность и чувствительность ПЦР существенно зависят от структуры праймеров, поэтому использование праймеров разных производителей может стать причиной различающихся результатов.

Другие аналитические технологии Разные варианты ПЦР считаются надежными лабораторными процедурами, способными обеспечить высокую чувствительность, специфичность и воспроизводимость. Несмотря на наличие технической возможности определить повышенный уровень протромбина, диагностика этой тромбофилии должна быть основана исключительно на применении вариантов ПЦР.