Лабораторный диагноз инфекционного заболевания

Общие типы анализов включают микроскопию, тест-культуру, иммунологические тесты (анализы агглютинациии, такие как латекс-агглютинация, иммуноферментные анализы, вестерн-блот, тесты осаждения и тесты фиксации комплемента) и методы идентификации нуклеиновых и ненуклеиновых кислот. Обычно тест-культура - это золотой стандарт для идентификации микроорганизмов, но результаты могут быть недоступны в течение многих дней или недель. Кроме того, болезнетворные микроорганизмы могут быть выделены в культуре, что делает полезными альтернативные тесты. Когда по болезнетворному микроорганизму проведена тест-культура и он идентифицирован, лаборатория может также оценить его чувствительность к антибактериальным препаратам.

Некоторые тесты (например, окрашивание по Граму, обычная аэробная культура) могут обнаружить большое разнообразие болезнетворных микроорганизмов. В то же время некоторые возбудители могут быть не выявлены в анализах. Поэтому клиницисты должны знать об ограничениях каждого теста для конкретных микроорганизмов. В таких случаях врачи должны запрашивать анализы, специфичные для подозреваемого патогена (например, специальные красители или среда для культуры) или рекомендовать лаборатории выбирать определенные тесты.

Микроскопия

Микроскопия может быть сделана быстро, но точность зависит от опыта работника лаборатории и качества оборудования. Инструкции часто ограничивают использование врачами микроскопии в диагностических целях вне сертифицированной лаборатории.

Большинство экземпляров обрабатывают красителями, которые окрашивают болезнетворные микроорганизмы, что выделяет их на общем фоне, хотя могут использоваться влажные препараты неокрашенных образцов, чтобы обнаружить грибы, паразитов, информативные клетки влагалища, подвижные организмы (например, Trichomonas) и сифилис (микроскопией по методу темного поля). Обнаружение грибков может быть улучшено применением 10%-ной гидроокиси калия, чтобы растворить окружающие ткани и негрибковые организмы.

Клиницист просит провести окрашивание, основанное на вероятных болезнетворных микроорганизмах, но никакое окрашивание не является на 100% специфичным. Большинство образцов обрабатывают окрашиванием по Граму, а если подозреваются микобактерии, то кислотостойким окрашиванием. Однако некоторые болезнетворные микроорганизмы нелегко увидеть при использовании этих методов. В таких случаях требуются различные варианты окрашивания или другие методы идентификации. Поскольку микроскопическое обнаружение обычно требует концентрации микроба приблизительно 1х105/мл, большинство экземпляров биологических жидкостей (например, ЦСЖ) концентрируют (например, центрифугированием) перед проведением анализа.

Окрашивание по Граму. Окрашивание по Граму классифицирует бактерии согласно тому, сохраняют ли они кристаллическую фиолетовую окраску (грамположительный - синий цвет) или нет (грамотрицательный - красный). Кроме того, показывает морфологию клетки (например, бациллы, кокки) и ее организацию (например, скопления, цепочки, диплоиды). Такие особенности могут помочь в предварительном выборе антибиотиков в ожидании окончательной идентификации. Чтобы произвести окрашивание по Граму, лаборанты нагревают и фиксируют материал образца на предметном стекле, а затем окрашивают его последовательно по Граму красителем фиолетового цвета, йодом, ацетоном и контрастирующим красителем (как правило, сафранином).

Кислотостойкие и умеренные (модифицированные) кислотостойкие красители. Такие красители используются, чтобы идентифицировать кислотостойкие организмы (Mycobacterium sp.) и умеренно кислотостойкие организмы (прежде всего Nocardia sp.). Эти красители также полезны для окрашивания Rhodococcus и подобных родов, так же как ооцист некоторых паразитов (например, Cryptosporidium).

Хотя обнаружение микобактерий в мокроте требует только приблизительно 5 000-10 000 микроорганизмов/мл, микобактерии часто присутствуют в организме человека на более низких уровнях, таким образом, чувствительность метода весьма ограничена. Обычно несколько мл мокроты дезактивируют гидроокисью натрия и концентрируют центрифугированием для кислотостойкого окрашивания. Это улучшает диагностику, хотя некоторые умеренно кислотостойкие организмы трудно отличить от микобактерий.

Флуоресцентное окрашивание. Такие красители позволяют обнаружить возбудителей при более низких концентрациях (1х10⁴ клеток/мл). Примеры - оранжевый акридин (бактерии и грибы), родамин аурамина и аурамин О (микобактерии) и калькофлюор белый (грибы, особенно дерматофиты).

Соединение флуоресцентного красителя с антителом, направленным на болезнетворный микроорганизм (прямая или непрямая иммунофлюоресценция), увеличивает чувствительность и специфичность диагностики. Однако эти анализы трудно читать и интерпретировать, и немногие (например, прямые флуоресцентные анализы антител Pneumocystis и Legionella) коммерчески доступны и обычно используются.

Окрашивание тушью. Этот краситель используется, чтобы обнаружить главным образом Cryptococcus neoformans и другие скрытые грибки во взвеси отмытых клеток (например, осадок ЦСЖ). Окрашивается второстепенная область, а не организм непосредственно, что дает возможность увидеть любую капсулу вокруг организма как ореол. При других возбудителях тест не столь чувствителен, как при обнаружении криптококкового антигена. Специфичность метода также ограничена: лейкоциты могут казаться скрытыми возбудителями.

Окрашивание по Райту и Гимза. Такие красители используются для обнаружения паразитов в крови, Histoplasma capsulatum в фагоцитах и клетках ткани, внутриклеточных включений, сформированных вирусами и хламидиями, трофозоитов Pneumocystis jirovecii и некоторых внутриклеточных бактерий.

Трихромное окрашивание (окраска Гомори - Уитли) и окрашивание железным гематоксилином. Эти красители используются, чтобы обнаружить кишечных простейших.

Краситель Гомори - Уитли используется, чтобы обнаружить микроспоридии. Он может не выявить яйца гельминтов и их личинки; не всегда достоверно идентифицирует Cryptosporidium. Грибы и клетки человека также окрашиваются.

Железный гематоксилин дифференцированно окрашивает клетки, включения клеток и ядра. Яйца гельминтов могут окраситься в слишком темный цвет, что затрудняет идентификацию.

Культура

Тест-культура - рост микробов на питательной твердой или жидкой среде; увеличение числа организмов упрощает идентификацию. Культура также облегчает тестирование антибактериальной восприимчивости.

Связь с лабораторией важна. Хотя большинство образцов материала высевают на среду общего назначения (например, кровь или шоколадный агар), некоторые болезнетворные микроорганизмы требуют включения определенных питательных веществ и ингибиторов или других специальных условий; если один из этих болезнетворных микроорганизмов подозревается или если пациент принимал антибактериальные препараты, нужно об этом сообщить в лабораторию. Об источнике образца сообщают такие данные, чтобы лаборатория могла дифференцировать возбудителей от нормальной микрофлоры.

Забор образца важен. Неправильный тип тампона может привести к ложно-отрицательным результатам. Деревянные стержни палочки для мазка токсичны к некоторым вирусам. Палочки для мазка с ватным кончиком токсичны для некоторых бактерий и хламидий. Гемокультуры требуют дезактивации и дезинфекции кожи (например, мазку повидон йода дают высохнуть и удаляют 70%-ным спиртом). Обычно используются множественные образцы, каждый из отдельного места; забор желательно проводить на высоте лихорадки, если это возможно. Нормальная флора кожи и слизистых мембран, которая растет даже в одном образце крови, интерпретируется как заражение. Если проба крови получена из центральной вены или артерии, образец периферической крови также должен быть взят, чтобы помочь дифференцировать системную бактериемию от инфекции катетера. Культуры с зараженных катетеров обычно становятся положительными более быстро и содержат больше организмов, чем одновременно взятые культуры периферической крови. Некоторые грибы, особенно почвы (например, Aspergillus sp.), обычно не могут культивироваться из образцов крови.

Образец следует быстро транспортировать, в правильной среде и в условиях, которые ограничивают рост любой другой потенциально заражающей флоры. Для точного определения количества болезнетворного микроорганизма должен быть предотвращен дополнительный патогенный рост; экземпляры должны быть немедленно транспортированы в лабораторию или, если транспорт задерживается, помещены в холодильник (в большинстве случаев).

Для определенных культур существуют особые условия.

Анаэробные бактерии не должны исследоваться в тест-культуре, т.к. дифференцирование болезнетворных микроорганизмов от нормальной флоры чаще всего невозможно. Образцы проб должны быть защищены от воздуха. Для мазков используются анаэробные транспортные среды. Образцы проб, собранные при помощи шприца (например, содержимое абсцесса), должны транспортироваться в шприце.

Микобактерии культивировать трудно. Экземпляры, содержащие нормальную флору (например, мокрота), должны сначала быть дезактивированы и сконцентрированы. Mycobacterium tuberculosis и некоторые другие микобактерии растут медленно. Рост М. tuberculosis, как правило, происходит быстрее в жидкости, чем в твердой среде. Обычно использование автоматизированных систем с жидкой средой может привести к росту в пределах 2 нед по сравнению с >4 нед на твердой среде (агар Ловенштейна - Дженсена). Кроме того, в экземпляре может присутствовать небольшое число организмов. Забор нескольких экземпляров из одного и того же места может помочь увеличить вероятность обнаружения возбудителя. В течение 8 нед засеянные среды не должны выбрасываться. Если подозревается нетипичная микобактерия, об этом следует уведомить лабораторию.

Вирусы обычно культивируются по мазкам и образцам ткани, обычно транспортируемым в средах, которые содержат антибактериальные и противогрибковые вещества. Содержимое образцов проб инокулируется в культуру тканей, которые поддерживают рост вируса и ингибируют все другие микробы. Вирусы, которые очень неустойчивы (например, вирус зостер), должны инокулироваться в культуру тканей в пределах 1 ч после забора. Стандартная культура клеток тканей является самой чувствительной. Ускоренная культура клеток тканей (метод бляшек: подсчет пятен на клеточном монослое) может обеспечить получение более быстрых, но ориентировочных результатов. Некоторые распространенные вирусы нельзя обнаружить, используя обычные методы культуры тканей; требуются альтернативные методы диагностики.

Образцы грибов, полученные из нестерильных мест, должны быть инокулированы в среду, содержащую антибактериальные вещества. Экземпляры нужно сохранять в течение 4 нед, прежде чем выбросить.

Анализ на чувствительность

Анализы на чувствительность определяют устойчивость микроба к антибактериальным препаратам путем воздействия на него стандартизированных концентраций антибактериальных препаратов. Анализ на чувствительность можно проводить для бактерий, грибов и вирусов. Для некоторых организмов результаты, полученные по одному препарату, предсказывают результаты по подобным лекарствам. Таким образом, не все потенциально активные препараты проверяются.

Анализ на чувствительность проводится в пробирке и, возможно, не учитывает многих факторов естественных условий (например, фармакодинамику и фармакокинетику, особенность концентрации препарата в определенных тканях и органах, иммунитет организма человека), которые влияют на успех лечения. Таким образом, результаты анализов на чувствительность не всегда предсказывают исход лечения.

Анализ на чувствительность может быть качественным, полуколичественным или с использованием методов выделения нуклеиновых кислот. Анализ позволяет также оценить эффект совместного применения различных антибактериальных препаратов (тестирование совместных эффектов).

Качественные методы. Качественные методы менее точны, чем полуколичественные. По результатам обычно фиксируют чувствительность (S), промежуточный результат (I) или резистентность (R). Обычно используемый дисковый метод диффузии (также известный как тест Кирби - Бауэра) подходит для быстро растущих организмов.

Пропитанные антибиотиком диски помещают в агаровые пластины, на которых находится тестируемый микроорганизм. После инкубации (как правило, 16-18 ч) измеряется диаметр зоны ингибиции вокруг каждого диска. У каждой комбинации антибиотик-микроорганизм есть различные диаметры, имеющие значение S, I или R.

Другие методы, которые требуют менее четкого соблюдения параметров анализа, могут использоваться, чтобы быстро проверить резистентность отдельного организма к отдельному препарату или классу препаратов или к определенным антибактериальным комбинациям (например, резистентность к оксациллину у метициллин-резистентного Стафилококка aureus, продуцирование В-лактамазы).

Полуколичественные методы. Полуколичественные методы определяют минимальную концентрацию препарата, который тормозит рост определенного организма в пробирке. Эту минимальную подавляющую концентрацию (МПК) фиксируют как число, которое может затем быть учтено как одно из 3 групп: S (чувствительный), I (промежуточное звено) или (резистентный) R. Определение МПК используется прежде всего для бактерий, включая микобактерии и анаэробы, иногда используется для грибов, особенно вида Candida, полученных из стерильных мест. Минимальная обезвреживающая (бактерицидная) концентрация (МБК) может также быть определена, но технически это трудно, и стандарты для интерпретации еще не согласованы. Ценность анализа МБК состоит в том, что он указывает, может ли препарат быть бактериостатическим или бактерицидным.

Антибиотик может быть растворен в агаре или бульоне, в который затем добавляют микроорганизм. Посветление бульона - золотой стандарт, но он является трудоемким, потому что только одна концентрация препарата может быть проверена в одной пробирке. Более эффективный метод использует стрип-полоску пленки из полиэстера, пропитанную антибиотиком в соответствующей концентрации. Полоску кладут на агаровую пластинку, содержащую вводимый материал, и МПК определяется по месту на полоске, где начинается ингибиция; большое количество антибиотиков можно проверить на одной пластинке.

МПК позволяет осуществить корреляцию между чувствительностью микроорганизма к препарату и достижимой концентрацией препарата в ткани, не связанной с белком (свободный препарат). Если концентрация в ткани свободного препарата выше, чем МПК, то вероятность успешного лечения высока. Точно так же данные об S, I и R коррелируют с МПК. Они обычно основаны на достижимой концентрации свободного препарата в сыворотке или плазме.

Методы выявления нуклеиновых кислот. Эти анализы, основанные на методах выявления нуклеиновых кислот похожи на те, которые используются для идентификации микроорганизма, но модифицированы, чтобы обнаружить известные резистентные гены или мутации. Пример - mecA, ген резистентности к оксациллину у S. aureus; если этот ген присутствует, то микроорганизм считают стойким ко всем β-лактамным антибиотикам. Хотя известно множество таких генов, но их выявление не дает права однозначно судить о резистентности в естественных условиях. Кроме того, поскольку могут присутствовать новые мутации или другие гены резистентности, их отсутствие не гарантирует чувствительности к препарату. По этим причинам и потому, что тесты ограничены в числе и являются дорогостоящими, они широко не применяются. Методы выявления нуклеиновых кислот не заменили стандартную тест-культуру и обычный анализ на чувствительность.

Иммунологические тесты на инфекционное заболевание

Иммунологические тесты используют антиген, чтобы обнаружить антитела к болезнетворному микроорганизму или используют антитело, чтобы обнаружить антиген патогена в образце пациента. Обработка меняется, но если анализ нужно отсрочить, то образец, как правило, следует поместить в холодильник или заморозить, чтобы предотвратить чрезмерно быстрый рост бактерий.

Тесты агглютинации. В тестах агглютинации (например, латексная агглютинация, коаггрегация) частица (латексная бусинка или бактерия) соединяется с антигеном или антителом реагента. Получающаяся комплексная частица смешивается с образцом (например, ЦСЖ, сыворотка); если искомое антитело или антиген присутствуют в экземпляре, то наступает перекрестное связывание частиц в виде их агглютинации, которую можно измерить.

Если результаты положительны, исследуемая биологическая жидкость последовательно разводится и проверяется. Агглютинация с более разведенными растворами указывает на более высокие концентрации целевого антигена или антитела. Титр правильно фиксировать как реципрокный при агглютинации в самом разведенном растворе; например, 32 указывает, что агглютинация произошла в растворе, разведенном 1/32 от начальной концентрации.

Обычно тесты агглютинации быстрые, но менее чувствительны, чем многие другие методы. Они могут также определять серотипы некоторых бактерий.

Фиксация комплемента. Этот анализ измеряет потребление комплемента (фиксацию комплемента) у антитела в сыворотке или ЦСЖ. Тест используется для диагноза некоторых вирусных и грибковых инфекций, особенно кокцидиомикоза. Образец инкубируется при известных количествах комплемента и антигена. Степень фиксации комплемента указывает на относительное количество антитела в образце. Анализ может измерить титры антитела IgM и IgG или может быть модифицирован, чтобы обнаружить определенные антигены. Анализ точный, но имеет ограниченное применение, является трудоемким и требует многочисленных средств по контролю.

Иммуноферментный анализ. Эти тесты используют антитела, связанные с ферментами, чтобы обнаружить антигены или обнаружить и определить количество антител. Иммуноферментный анализ (ИФА) и иммуноферментный анализ, связанный с фермент-связанным иммуносорбентом (ЭЛИЗА) являются наиболее используемыми. Поскольку чувствительность большинства иммуноферментных анализов высокая, то они обычно применяются для скрининга. Титры могут быть определены последовательным разведением образца, как и при тесте на агглютинацию.

Чувствительность анализа хотя обычно и высокая, может изменяться в зависимости от возраста пациента, серотипа микроба, типа образца или стадии клинической болезни.

Анализ на осаждение. Эти анализы измеряют антиген или антитело в жидкостях тела степенью видимого осаждения комплексов антигена-антитела в пределах геля (агароза) или в растворе. Есть много типов анализа на осаждение (например, двойная диффузия по Оухтерлони, противоточный иммуноэлектрофорез), но их применение ограничено. Обычно проба крови смешивается с тестируемым антигеном, чтобы обнаружить защитные антитела, чаще всего при грибковой инфекции или пиогенном менингите. Поскольку положительный результат требует большого количества антитела или антигена, чувствительность низкая.

Анализ вестерн-блота. Этот анализ выявляет антибактериальные антитела в образце материала, взятом от пациента (например, сыворотка, другая жидкость тела) по их реакции с антигенами (например, вирусные компоненты), которые были иммобилизированы на мембрану блоттингом.

У анализа вестерн-блота, как правило, хорошая чувствительность, хотя часто меньшая, чем у скрининговых тестов, таких как ЭЛИЗА, но в общем он имеет высокую специфичность. Обычно используется, чтобы подтвердить положительный результат, полученный при скрининг-анализе.

Технические модификации вестерн-блота -линейный иммунологический анализ (ЛИА); рекомбинантный анализ иммуноблота (RIBA), который использует синтетические или реком-бинант-продуцируемые антигены; и иммунохроматографический анализ, который может быстро проверить образцы на определенные микробные антигены или антитела больного.

Методы идентификации ненуклеиновых кислот для выявления инфекционного заболевания

Как только организм был выявлен тест-культурой, он должен быть идентифицирован. Методы выявления ненуклеиновых кислот используют фенотипичные (функциональные или морфологические) особенности микроорганизмов, а не генетическую идентификацию.

Особенности роста возбудителя на питательных средах - размер колонии, цвет и форма, дают информацию для идентификации разновидностей, а вместе с окрашиванием по Граму и алгоритм для дальнейших анализов. Доступны многочисленные биохимические тесты; каждый характерен для микроорганизмов определенного типа (например, аэробные или анаэробные бактерии). Некоторые оценивают способность организма использовать различные субстраты для роста. Другие оценивают наличие или активность ключевых ферментов (например, коагулаза, каталаза). Анализы делают последовательно, шаг за шагом. Последовательности тестов очень разнообразны и могут несколько отличаться в разных лабораториях.

Методы выявления ненуклеиновых кислот могут быть основаны на работе вручную, на автоматизированных системах или это могут быть хроматографические методы. Некоторые коммерчески доступные комплекты содержат батарею отдельных тестов, которые могут быть проведены при одновременном использовании одного образца материала и, как правило, полезны для диагностики широкого круга микроорганизмов. Такие системы анализа могут быть очень точными, но могут потребовать определенного времени, вплоть до нескольких дней.

Хроматографические методы. Микробные компоненты или продукты отделяются и идентифицируются при использовании высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) или газовой хроматографии. Обычно выявление идет путем сравнения жирных кислот организма с базой данных. Хроматографические методы могут использоваться, чтобы идентифицировать аэробные и анаэробные бактерии, микобактерии и грибы. Точность анализа зависит от качества тест-культуры образца и качества базы данных, которая может быть неточной или неполной.

Методы идентификации инфекционного заболевания, основанные на выявлении нуклеиновых кислот

Основанные на выявлении нуклеиновых кислот методы обнаруживают определенные для организма последовательности ДНК или РНК, извлеченные из микроорганизма. Последовательности могут быть амплифицированы в пробирке. Основанные на выявлении нуклеиновых кислот методы являются в целом специфичными и очень чувствительными и могут использоваться для всех категорий микробов. Результаты могут быть получены быстро. Поскольку каждый анализ, как правило, является специфичным для определенного организма, клиницист должен знать диагностические возможности и запрашивать соответствующий анализ. Например, если у пациента есть симптомы, предполагающие грипп, но сезон гриппа закончился, проведение более общего вирусного диагностического анализа (например, вирусная культура), а не определенного анализа на грипп лучше, потому что другой вирус (например, парагрипп, аденовирус) может быть причиной.

Основанные на определении нуклеиновых кислот тесты качественны, но количественные методы определения существуют для ограниченного, но увеличивающего числа инфекций (например, ВИЧ, цитомегаловирус, Т-лимфотропный вирус человека). Эти методы могут быть полезными для диагноза и для мониторинга ответа на лечение.

Методы, которые не задействуют амплификацию нуклеиновой кислоты, используются в тех случаях, когда организм был сначала обнаружен в тест-культуре и присутствует в образце в высокой концентрации.

Амплификация. При методах амплификации нуклеиновой кислоты берут крошечное количество ДНК или РНК, воспроизводят их много раз, и таким образом могут обнаружить небольшие следы микроорганизма в образце. Эти методы особенно полезны для возбудителей, которые трудно культивировать или идентифицировать использованием других методов (например, вирусы, облигатные внутриклеточные болезнетворные микроорганизмы, грибы, микобактерии, некоторые другие бактерии), или для тех организмов, которые присутствуют в малых количествах.

Эти анализы могут задействовать целевую амплификацию (например, ПЦР, обратная транскриптаза-ПЦР [RT-PCR], амплификация смещения цепи, амплификация транскрипции), амплификацию сигнала (например, анализ разветвленной ДНК, гибридный захват), амплификацию пробы (например, цепная реакция лигазы, внедряющийся вид расщепления, цикличные пробы) или анализ постамплификации (например, упорядочивание амплифицированного продукта, анализ микроматрицы и анализ кривой ликвидуса, как это делается в ПЦР в реальном времени).

Соответствующий забор образца и его хранение до прибытия в молекулярную диагностическую лабораторию важны. Поскольку методы амплификации столь чувствительны, легко могут быть установлены ложные положительные результаты от следа заражения образца или оборудования. Несмотря на высокую чувствительность, иногда случаются ложные отрицательные результаты, даже когда у пациента имеются клинические симптомы (например, при вирусной инфекции Западного Нила). Ложноотрицательные результаты могут быть минимизированы

• путем избегания использования палочек для мазков с деревянными стерженьками и наконечниками из ваты,
• быстрой транспортировкой образцов,
• заморозкой или помещением образцов в холодильник, если транспортировка займет >2 ч.

Замораживание - типичный метод хранения анализов амплификации нуклеиновых кислот. Однако образцы должны храниться в холодильнике, а не подвергаться заморозке, если подозреваются неустойчивые вирусы (например, вирус герпес-зостер, вирус гриппа, ВИЧ-2) или если планируется исследование вирусных культур (замороженные экземпляры не годятся для стандартных культур).