Генная и иммунотерапия рака

Поэтому растет интерес к новым методам прицельной (таргетной) терапии.

Под генной терапией понимают перенос генетического материала с лечебной целью в клетку, ткань или орган, где этот материал начинает экспрессировать специфический генный продукт.

Достижения в области рекомбинантной ДНК-технологии позволяют по-новому взглянуть на рост человеческих клеток, механизмы его регуляции и его нарушение при опухолевом процессе.

Для успешной генной терапии необходимо следующее:

• идентифицировать и изолировать функционирующий ген, который после введения в клетку, ткань или орган устранит генетическое нарушение;
• разработать метод доставки гена в клетку;
• уметь управлять экспрессией введенного гена.

Несмотря на то что в мире выполнено более 600 клинических

исследований по генной терапии, большинство их представляет лишь фазы I и II клинических испытаний. В настоящее время еще нет официально разрешенной для клинического применения методики генной терапии. В Соединенном Королевстве эта проблема находится в ведении Консультативного комитета по генной терапии. Как и в случае других новых методов лечения, генную терапию пока пробуют у больных с далеко зашедшей стадией рака. Однако в будущем, по-видимому, ее роль будет особенно значительна при лечении рака на ранней стадии или после хирургического удаления опухоли (т.е. ее будут применять в качестве адъювантной терапии).

Разрабатываемые в настоящее время методы в области генной терапии отчасти применяют также в иммунотерапии рака, что сближает эти два направления в одно — иммуногенетику рака.

Иммунотерапия основана на воздействии на иммунологические механизмы развития злокачественной опухоли. Это воздействие направлено как на повышение активного иммунитета, так и на создание пассивного с помощью биологических препаратов.

Иммунотерапия может быть двух видов:

• неспецифической;
• специфической — с помощью препаратов, связывающихся с опухолевыми антигенами.

Идея создания противораковой вакцины не нова. Она впервые возникла в период, когда была доказана роль инфекционного начала в развитии некоторых опухолей:

• ВЛЧ — рака шейки матки;
• HBV — печеночно-клеточного рака;
• ВЭБ — лимфомы Беркитта и рака носоглотки.

Затем было высказано предположение о том, что с помощью вакцин против специфических опухолевых антигенов, по-видимому, можно лечить и опухоли, инфекционная природа которых не доказана. Преимуществом такого метода лечения была бы возможность генерации специфического иммунного ответа после внедрения генного фактора, который бы подвергся амплификации и последующей диссеминации, воздействуя на опухолевые клетки в отдаленных частях тела. В большинстве современных «следований по генной терапии используют иммуногенетические методы.

Подходы к генной терапии рака

Соматическая коррекция генного дефекта:

• экспрессия гена-супрессора опухолевого роста;
• прерывание экспрессии мугантного онкогена антисмысловыми олигонуклеотидами.

Генетическая активация пролекарства.

Генетическая иммуномодуляция:

• неспецифическая иммунотерапия;
• специфическая иммунотерапия.

Соматическая коррекция генного дефекта

Экспрессия гена-супрессора опухолевого роста

Гены-супрессоры опухолевого роста в процессе канцерогенеза утрачивают свои функции. Полная утрата функции подавления, инициирующая опухолевый рост или способствующая прогрессированию опухоли, происходит лишь при инактивации обоих аллелей гена. Например, ген р53 кодирует ядерный белок, действующий как фактор транскрипции, блокируя прогрессию опухоли. Приблизительно в 50% случаев рака у человека в опухолевых клетках выявляют мутантный белок р53, утративший свои функции. Мутации могут быть наследственными и приобретенными. К генам-супрессорам опухолевого роста относят также гены Rb1 (ретинобластома) и E-cadherin.

В экспериментах на моделях опухолей в условиях in vivo замена мутантного гена-супрессора опухолевого роста нормальными копиями генов с помощью вирусных векторов приводит к подавлению роста опухоли и восстановлению нормального фенотипа. Однако перенос этих предварительных результатов в клинику еще не дал обнадеживающих результатов. В фазах I и II клинических испытаний на больных НМРЛ с мутацией гена р53 введение в опухоль ретровирусного вектора с диким типом р53 не дало эффекта. Есть основания полагать, что успешная коррекция гена р53 в сочетании с химиотерапией, например цисплатином, можрт уменьшить опухолевую экспрессию в клетках этой линии.

Прерывание экспрессии мутаитмого онкогена антисмысловыми олигонуклеотидами

Протоонкогены — гены, активирующиеся в процессе канцерогенеза. Генным продуктом бывает белок (например, фактор роста или фактор транскрипции), играющий существенную роль в регуляции клеточной пролиферации. Для нарушения нормальной регуляции деления клеток протоонкогеном достаточно мутации (наследственной или приобретенной) лишь одной его копии. Антисмысловые олигонуклеотиды ДНК представляют собой короткие синтетические нуклеотидные последовательности, комплементарные специфическим последовательностям ДНК или РНК, которые конструируются на отдельных онкогенах. Цель применения антисмысловых олигону-клеотидов — подавление транскрипции в мРНК или трансляции с мРНК белка. Это ограничивает экспрессию гена и тем самым образование генного продукта.

Так, bcl-2 представляет собой онкоген, играющий роль в развитии рака простаты, резистентного к гормональной терапии. Экспрессия гена bcl-2 способствует профессии опухоли. Гиперэкспрессия bcl-2 вызывает резистентность клетки к апоптозу. Этот ген представляет собой мишень антисмысловой молекулы G3139. Препарат облимерсен (генасенс), созданный на основе этого олигонуклеотида, в настоящее время проходит клинические испытания на больных с далеко зашедшим раком простаты. Другим примером антисмыслового олигонуклеотида, проходящего клинические испытания, служит ISIS 3521 (аффинитак), его мишень — нерецепторная тирозинкиназа. плотность которой увеличивается при ряде солидных опухолей, включая НМРЛ.

Генная активация пролекарства

Основной недостаток современных химиопрепаратов — отсутствие избирательности действия. Повысить избирательность можно с помощью метода переноса генов. Таргетирование включает следующие этапы.

• Ген, кодирующий фермент, который активирует лекарство, внедряют в опухолевые клетки.
• После этого регулярно вводят пролекарство.
• Активирующий фермент превращает пролекарство в токсический метаболит
• Опухолевая клетка погибает в результате следующих изменений: локальное образование цитотоксического метаболита; так называемый эффект «свидетеля», при котором нетрансгенная клетка, находясь в смешанной популяции клеток, погибает в присутствии данного пролекарства вследствие диффузии последнего, активного транспорта и включения местного иммунного ответа; это может обеспечить эффективность метода даже при отсутствии высокоэффективного переноса гена.

Цель метода переноса генов — уничтожить максимальное количество опухолевых клеток, сведя к минимуму системные токсические эффекты.

Метод известен под разными названиями:

• терапия генной активацией пролекарства (GPAT — genetic pro-drug activation therapy);
• генная регуляция ферментной системы пролекарства (GDEPT — gene-directed enzyme pro-drug system);
• терапия, основанная на регуляции ферментов пролекарства с помощью вирусных векторов (VDEPT— virus-directed enzyme pro-drug therapy), перенос генов осуществляется с помощью вирусных векторов;
• суицидная генотерапия.

Основные недостатки метода генной активации пролекарства таковы:

• недостаточно эффективный перенос генов в опухолевые клетки, связанный с несовершенством имеющихся векторов;
• необходимость в непосредственной внутриопухолевой инъекции генов, при которой эффект не носит распространенный характер, а ограничивается лишь самой опухолью.

В настоящее время исследования, призванные ответить на вопрос, может ли энная активация пролекарства быть переведена из области теории в практическую плоскость, пока не завершены. Одним из прототипов ферментной системы пролекарства, активируемой геном, служит нитроредуктаза бактерий. Она превращает пролекарство СВ1954 (его можно вводить внутривенно или внутрибрюшинно, не опасаясь осложнений) в высокотоксичное алкилирующее вещество нитробензамидин. Ген нитроредуктазы можно было бы ввести в опухоль путем непосредственной инъекции. Последующее системное назначение пролекарства СВ1954 привело бы к отвращению его в цитотоксический нитробензамидин лишь в том случае, если ген встроился в клеточный геном. Терапевтическая эффективность этого метода пока не доказана, но исследования у больных раком печени в настоящее время продолжаются.

Генная иммуномодуляция

Неспецифическая иммунотерапия

Цель неспецифической иммунотерапии — повысить иммунный ответ вообще, а не вызвать иммунную реакцию против какого-либо конкретного антигена. Больного иммунизируют веществами, вызывающими иммунную реакцию, способную остановить или замедлить рост опухоли. Ранее были проведены исследования с БЦЖ и цитокинами, в частности ИФН альфа и ИЛ-2.

Специфическая иммунотерапия

Разрабатывают многочисленные методы индукции иммунного ответа на специфические опухолевые антигены.

Антигены-мишени должны обладать следующими свойствами:

• экспрессироваться только в опухолевых клетках и лишь в очень небольшом количестве в других тканях;
• экспрессироваться как клетками первичной опухоли, так и клетками ее метастазов;
• распознаваться иммунной системой либо на клеточной поверхности, либо в виде фрагментов, связанных с белками главного комплекса гистосовместимости (МНС).

В следующих разделах освещены разрабатываемые в настоящее время методы индукции специфических противоопухолевых иммунных реакций.

Препараты из цельных опухолевых клеток

Индивидуальные вакцины для каждого больного, создаваемые на основе материала, полученного из собственной опухоли, и обычно вводимые с адъювантным препаратом, например БЦЖ.

Отпадает необходимость в идентификации специфических опухолевых антигенов.

Возможности получения высокоиммуногенных вакцин для клинического применения ограничены.

Получены обнадеживающие результаты применения противоопухолевой вакцины на небольшой группе больных, прооперированных по поводу рака толстой кишки. Вакцина несколько увеличивала продолжительность безрецидивного периода.

Пептидные вакцины

Если выделить и идентифицировать опухолевый антиген, то пептиды, полученные из этого антигена, можно использовать в качестве элитопов для иммунотерапии. Для стимуляции иммунитета можно использовать также синтетические эпитопы. До настоящего времени в клинике испытывали внутрикожное или подкожное введение, обычно в сочетании с иммунологическим адъювантом БЦЖ. Дальнейшее введение антигена повышает возможность распознавания опухоли благодаря иммунологическому надзору и, следовательно, ее отторжения. Примером специфического опухолевого пептидного антигена, в настоящее время изучаемого, служит Муцин. Он представляет собой высокомолекулярный гликопротеид, экспрессируемый на клетках слизистой оболочки ЖКТ. При ряде злокачественных опухолей, в том числе раке поджелудочной железы и толстой кишки, отмечают его гиперэкспрессию. Пока еще недостаточно данных, подтверждающих корреляцию между иммунным ответом и клиническим эффектом.

ДНК-вакцины

Вместо использования в качестве антигена опухолеспецифического белка можно выбрать в качестве мишени ген, претерпевающий гиперэкспрессию у больных с опухолью. Для этого нужно создать рекомбинантную ДНК-вакцину, в которой используется вектор для переноса ДНК, кодирующей опухолеспецифический белок. Представление антигенного белка индуцирует гуморальный и клеточный иммунитет. В качестве мишеней для ДНК-вакцин выбирают следующие субстраты.

• Мутантный ген-супрессор опухолевого роста 053. присутствующий более чем у 50% больных раком.
• Раково-эмбриональный антиген — гликопротеин клеточной мембраны, его гиперэкспрессию отмечают у большинства больных раком толстой кишки. В норме низкий уровень экспрессии этого антигена отмечают в клетках слизистой оболочки толстой кишки и желчных путей. Ген. кодирующий раково-эмбриональный антиген, встраивают в различные векторы для применения в качестве вакцины. Хотя многочисленные клинические испытания в фазах I и II подтвердили хорошую переносимость ДНК-вакцин против раково-эмбрионального антигена, доказательств его клинической эффективности пока нет
• MAGE-1 — эмбриональный генный продукт, ассоциированный с раком молочной железы и меланомой.
• Белок Her-2/neu — рецептор ЭФР, внутриклеточный домен которого обладает тирозинкиназной активностью.

Недостаток метода ДНК-вакцин — ограниченное количество опухолеспецифических антигенов. Большинство антигенов-мишеней не бывают строго специфичными для опухоли и экспрессируются, хотя и в меньшем количестве, нормальными клетками. Противоопухолевые вакцины еще должны пройти клинические испытания.

Вакцинация дендритными клетками

Воздействие на иммунную систему, чтобы избирательно нацелить ее против опухолевой ткани, связано с многочисленными трудностями. Крайне важен выбор подходящего антигена. Однако успех зависит также от оптимального представления этих антигенов иммунной системе. Необходимость обеспечить эффективное представление привела к введению антигенов с дендритными клетками. Дендритные клетки обладают выраженной способностью процессинга и представления антигена, необходимой для развития первичного ограниченного по HLA Т-клеточного иммунитета, столь важного при инфекциях, аутоиммунных заболеваниях и злокачественных опухолях. Эти клетки экспрессируют значительное количество молекул HLA и других мембранных молекул. Достижения последних лет в технологии исследований позволили культивировать дендритные клетки in vitro из предшественников, получаемых из крови и костного мозга с использованием дитокинов. В культивируемые дентритные клетки можно ввести экзогенный антиген например, опухолевый белок, пептид или РНК) или ген, кодирующий опухолевый антиген (с помощью переноса физическими методами или вирусными векторами). Можно надеяться, что одновременное введение с дендритными клетками антигена максимально усилит последующий Т-клеточный ответ и, следовательно, улучшит опознавание опухолевого пептида. Однако дендритные клетки трудно культивировать, а клинических испытаний, проведенных к настоящему времени, немного, и асе они находятся лишь на ранней стадии.

Доставка генов

Для успеха генной терапии необходимы системы доставки, с помощью которых ложно эффективно перенести ген без ущерба для клетки. Методов доставки генов несколько.

Физические методы:

• инъекция ДНК в скелетную мышцу с помощью обычного шприца и иглы;
• перенос ДНК с помощью липосом;
• баллистическая трансфекция с помощью микрочастиц золота, покрытых плазмидой ДНК («генная пушка»).

Преимущества физического метода — удобство и безопасность. К недостаткам относят низкую эффективность переноса гена и преходящий характер его экспрессии.

Биологические методы, например перенос с помощью:

• бактериальных векторов;
• вирусных векторов.

Преимущество использования биологических векторов в том, что это наиболее эффективный и стабильный метод, обеспечивающий встраивание ДНК в значительное количество кпеток-мишеней. К недостаткам этого метода относят сложность методики и возможность образования в организме хозяина нейтрализующих антител.

Системному введению генов препятствуют следующие факторы:

• высокая частота перекрестной иммунной реакции с антителами;
• высокая иммуногенность векторов.

Поэтому перенос генов биологическим методом осуществляют путем местной инъекции.

Выбор вектора для переноса ДНК зависит от цели лечения:

• для замены гена желательно использовать высокоэффективные вирусные векторы;
• для непродолжительного эффекта, необходимого для индуцирования иммунного ответа или сенсибилизации клеток к лучевой терапии, можно использовать липосомы.

Доставка может быть следующих видов:

• ex vivo — перенос лечебного гена в изолированную опухоль или раковые клетки, которые затем реимплантируют в организм хозяина;
• in vivo — доставка генов к клеткам-мишеням, основанная на различиях в транскрипции специфических генов между опухолевыми и нормальными клетками; этот метод для переноса генов менее эффективен.